Une mosaïque de méthodes

Je vais essayer de me concentrer sur le diagnostic de Covid-19 non pas comme un outil clinique mais comme un outil de surveillance épidémiologique dont nous avons grandement besoin Si nous devons un jour revenir à ce qui peut être la nouvelle norme. Cela signifie qu'en plus d'être précise, la méthodologie utilisée doit être adaptée à un déploiement géographique étendu (notamment l'échantillonnage), une détection précoce (avant même l'apparition des symptômes), évolutive (automatisation) et éviter les retards dans la circulation des informations.
En ce qui concerne la précision, les conditions requises sont les mêmes que pour le diagnostic clinique: la méthode doit être précise (reproductible), sensible (positive / infectée> 85%) et spécifique (négative / non infectée la plus proche de 100%). Toutes ces mesures d'efficacité diagnostique sont relatives, obtenues par comparaison avec ce qui est considéré comme l'étalon-or pour un pathogène particulier. L'étalon-or pour la détection de Covid-19 est basé sur l'amplification des acides nucléiques viraux par des tests RT-PCR (NAAT). Dans le cas des TAAN pour les maladies virales, la sensibilité peut être mesurée comme le nombre de copies du génome viral par test requis pour des résultats positifs à 100%. Les méthodes RT-PCR quantitatives en temps réel sont assez sensibles, détectant aussi peu que 3 copies du génome en une seule réaction (1). Des kits NAAT bien conçus sont également très spécifiques et une amplification parasite (artefacts de réaction) ou une amplification de génomes autres que le SRAS CoV 2 peut être exclue dans les meilleures conditions de laboratoire (1).
Etant vrai que les TAAN sont assez sensibles et spécifiques, et peuvent être automatisés, il y a des problèmes avec le A ”pour l'amplification. Étant si sensible, vous pouvez amplifier les génomes viraux obtenus en échantillonnant des individus infectés et / ou présents dans la réaction par contamination environnementale n'importe où dans le processus. Il en résulte des faux négatifs, une spécificité plus faible. Ainsi, des précautions sont nécessaires dans l'ensemble du processus de test, en particulier pendant l'échantillonnage, car les conditions de laboratoire sont mieux contrôlées que les ensembles d'échantillonnage et les contrôles internes peuvent détecter ou exclure la contamination du laboratoire.
En outre, une telle sensibilité élevée ne se traduit pas nécessairement par une valeur optimale de sensibilité dans le monde réel (positifs / infectés). Les problèmes d'échantillonnage ou de transport / stockage, ainsi que l'étendue / l'état très variable de l'infection chez chaque sujet testé peuvent réduire considérablement la sensibilité. L'échantillonnage est probablement l'un des facteurs les plus importants réduisant la sensibilité de la méthode et doit être effectué par des personnes formées. L'échantillonnage se fait généralement par écouvillonnage des voies nasopharyngées et / ou oropharyngées (Upper Resp. Tract, URT) car il est pratique et rapide. Certaines études indiquent que la combinaison des deux (nasale + orale) donne les meilleurs résultats (2). Cependant, les infections à Covid-19 dans l'URT peuvent ne pas être très étendues et constantes dans le temps car il y a eu plusieurs rapports indiquant, par exemple, que les individus symptomatiques se sont révélés négatifs uniquement pour être positifs dans un deuxième test.
En outre, il semble qu'il existe, dans la population en général, une grande variabilité dans le développement de l'infection URT qui sera assortie d'une variabilité similaire de la sensibilité. Les informations sur la dynamique des infections dans l'URT sont rares, probablement parce que ce n'est pas si important du point de vue clinique. Néanmoins, cela est essentiel du point de vue épidémiologique et la capacité du SRAS CoV 2 à infecter et à se répliquer dans l'URT est ce qui le distingue du SARS1.0 (3) moins infectieux. Cet article montre que la fenêtre pour une détection précise de Covid-19 dans les écouvillons URT chez les sujets symptomatiques par les TAAN se situe entre 6 et 14 jours après l'apparition des symptômes, avec de meilleurs résultats entre 7 et 11 d.a.s.a. Il s'agit d'une opportunité étroite pour la précision des tests lorsque vous testez de nombreuses personnes.
On sait très peu de choses sur les individus asymptomatiques ou presque asymptomatiques, mais il a été démontré qu'ils peuvent se révéler positifs lors des tests et être facilement infectés (3). Tout cela se traduit par une sensibilité plus faible que prévu et une certaine perplexité parmi les médecins. En outre, il y a des erreurs: les erreurs d'étiquetage et de suivi des échantillons ne sont pas rares, en particulier dans les situations stressantes. Pour compliquer l'image, les symptômes signalés au cours de la première semaine sont assez variables, mais toute personne ressentant de la fièvre, de la toux, des céphalées, une rhinite ou une sinusite doit être testée. Composé d'allergies généralisées pour rendre les symptômes plus peu fiables.
Même avec les limites méthodologiques exposées, les TAAN bien conçus, validés et exécutés par du personnel correctement formé (et protégé) sont un outil très utile pour la surveillance épidémiologique, comme l'a démontré la Corée du Sud. Pour avoir une idée de ce qui est nécessaire, comment l'échantillonnage est effectué et comment le système HC doit être protégé, je recommande de regarder cette vidéo:? V = b0D8b1WZJTM, en particulier allez à la minute 14 pour voir les procédures d'échantillonnage correctes lors d'un test au volant ensemble. Vous verrez que l'écouvillon nasopharyngé est beaucoup plus méchant que celui de l'oropharynx.
Et une conclusion importante que l'on peut tirer de cette vidéo est qu'il ne s'agit pas uniquement de la méthode de diagnostic. Une surveillance et un confinement efficaces nécessitent des mesures supplémentaires telles que l'éloignement social, la notification graissée, la surveillance de la fièvre et la population dans son ensemble doit collaborer à la surveillance et au confinement. Les remarques du professeur Schaffner à environ 3 h 30 min de la vidéo sont tout à fait correctes. Ma conclusion est que les limites de la méthode peuvent être surmontées avec de nombreux tests fréquents et répétés qui s'étendent bien au-delà des cas symptomatiques signalés. En outre, l'isolement des positifs empêchant les contagions à domicile pourrait être nécessaire ou au moins souhaitable dans les cas où l'auto-isolement est difficile. Dans tous les cas, les difficultés connues avec les TAAN ont déclenché des recherches sur des méthodes alternatives.
Je vais ignorer les tests immunologiques (détection d'antigènes ou d'anticorps) car il faut plus de temps pour la production et la validation des kits et beaucoup d'entre eux présentent des inconvénients pour le déploiement dans la surveillance épidémiologique (5). Certains ne sont pas assez sensibles tandis que d'autres sont sensibles mais pas facilement évolutifs, etc. Détecter les anticorps est important d'un point de vue clinique et également du point de vue épidémiologique pour avoir une idée de l'état de l'immunité dans la population, mais il y a des problèmes à discuter qui rendrait cela trop long.
Pourtant, il existe d'autres méthodes basées sur NAT. Il existe des NAT qui évitent l'amplification et sont très sensibles, par exemple les méthodes basées sur CRISPR (un couple mentionné en 5). D'autres ensembles de méthodes sont basés sur le séquençage de l'ARN. Le séquençage de nouvelle génération, HiSeq, le séquençage d'ARN unicellulaire et / ou le séquençage d'ARN unicellulaire sont des méthodes en évolution rapide qui ont été développées pour étudier et diagnostiquer un éventail de maladies non infectieuses et infectieuses. Celles-ci sont basées sur le séquençage de tous les ARNm cellulaires, le transcriptome », qui comprendra les ARN viraux s'ils sont infectés. Les séquences obtenues sont filtrées in silico pour éliminer les séquences humaines et vous pouvez ensuite obtenir des séquences d'ARN viral spécifiques. Vous pouvez exécuter un «blast» (outil de comparaison massive de séquences avec des bases de données existantes) avec les séquences obtenues et obtenir des résultats non biaisés: c'est certainement Covid-19, ou non, c'est la grippe H5N1.
Ces types de tests, bien que complexes et nécessitant une formation supplémentaire, peuvent être facilement automatisés, étendus (multiplexables »dans le jargon) et certains d'entre eux ne dépendent pas de la disponibilité des kits de traitement. Des investissements dans des équipements coûteux sont nécessaires mais ils sont déjà disponibles dans certains centres de recherche.
Ces méthodes, par rapport à la qPCR en temps réel, offrent plusieurs avantages: l'agent pathogène est simultanément détecté et génotypé, les contrôles internes garantissent une meilleure ambiguïté qu'avec la qPCR et il n'y a pas de risques associés à l'amplification. Je ne peux pas montrer de liens, mais selon les communications personnelles, la sensibilité peut être plus élevée d'un ordre de grandeur en termes de nombre de cellules infectées nécessaires à la détection de virus, de sorte que ces méthodes peuvent permettre une détection de contagion plus précoce que les TAAN. En ce qui concerne la vitesse, les résultats peuvent être obtenus en quelques heures, similaires aux TAAN dans ce sens.
Les problèmes sont que la standardisation des procédures est nécessaire, suivie d'une validation par rapport à l'étalon-or, et dans de nombreuses régions du monde il n'y a pas d'équipement ni de personnel qualifié disponible. Il existe déjà certains systèmes commerciaux basés sur ces techniques utilisant des plates-formes légèrement différentes uniquement à des fins de recherche. À ma connaissance, certains sont en cours de validation pour Covid-19 dans au moins quatre pays. Cette épidémie pourrait voir l'essor de ces techniques comme la nouvelle référence pour le diagnostic clinique des maladies virales.
Quoi qu'il en soit, l'expérience sud-coréenne, ainsi que d'autres expériences plus négatives - par exemple, l'Espagne manque de kits de traitement importés pour les NAATS - suggère que chaque pays prendra des décisions pour s'assurer qu'il dispose des ressources nécessaires pour poursuivre ses programmes de surveillance. sans dépendre des plates-formes technologiques développées par des fournisseurs potentiellement peu fiables. Cela suggère que nous pourrions terminer avec une mosaïque de méthodes de diagnostic développées et validées dans chaque région.
Détection du nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) par RT-PCR en temps réel
Évaluation virologique des patients hospitalisés avec COVID-2019. -020-2196-x_reference.pdf
Alerte pour les symptômes non respiratoires des patients atteints de la maladie de coronavirus 2019 (COVID-19) en période épidémique: rapport de cas d'un cluster familial avec trois patients COVID-19 asymptomatiques.